ХАРАКТЕРИСТИКА иммунологических методов анализа и диагностики

Реакции специфического взаимодействия сывороточных антител с антигенами, против которых они направлены, проявляются в виде нескольких основных феноменов. Эти феномены легко наблюдать в лабораторных условиях.

Феномен агглютинации заключается в том, что бактерии, животные клетки или другие корпускулярные антигенные частицы, находящиеся во взвеси, под влиянием антител склеиваются между собой. Иначе говоря, если к взвеси бактерий в изотоническом растворе хлорида натрия (реакция идет только в присутствии электролитов) добавить сыворотку иммунизированного этими бактериями животного, то микроскопические элементы взвеси склеиваются между собой и оседают на дне пробирки в виде крупных, различимых невооруженным глазом хлопьев или зерен. Аналогичное явление происходит и при использовании, например, эритроцитов барана и сыворотки животных, которым вводили эти эритроциты.

В лабораториях весьма часто используют не прямую, а пассивную агглютинацию. Этот вариант реакции применяют при работе с растворимыми антигенами и др. Для получения феномена агглютинации антиген предварительно присоединяют к корпускулярному носителю - танированным эритроцитам, частицам латекса, окиси бария и др. Добавление антител к взвеси таких частиц - пассивных носителей антигена, приводит к их склеиванию. Реакция пассивной агглютинации характеризуется высокой чувствитель-ностью и пригодна для выявления весьма малых количеств антител.

Следует отметить, что в реакциях агглютинации и многих других по выявлению антител количество антител в иммунной сыворотке или в других жидкостях оценивается их титром.

Под титром антител понимают то наибольшее разведение сыворотки или иной жидкости, при котором реакция антиген - антитело все еще учиты­вается. Например, титр антител может быть равен 1 :28 или 1 :2048. Каждое последующее разведение сыворотки ,. обычно вдвое больше предыдущего (1 : 2, 1: 4, 1 : 8 и др.).

Феномен преципитации - эффект укрупнения растворимых антигенных субстанций под влиянием антител с возникновением помутнения прозрачных растворов. В этом случае мы сталкиваемся с явлением агрегации растворенных частиц. В зависимости от технических условий постановки и учета данной реакции антиген - антитело они получили разные названия.

Классическая реакция преципитации.

Если раствор антигена в определенном соотношении смешивают с антисывороткой, то образуется преципитат. Количественный анализ этого процесса (например, методом, который схематически изображен на рис.1) дает информацию как о содержании, антнтел в иммунной сыворотке, так и о валентности антигена, т. е. числе участков связывания с антителами (эпитопов). Эта величина может существенно варьировать в зависимости от структуры антигена, его размеров, а также вида животного, от которого были получены антитела.

В случае гипериммунной кроличьей антисыворотки, содержащей преимущественно иммуноглобулины класса G(IgG), овальбумин проявляет валентность, примерно равную 10, а у тиреоглобулина человека обнаруживается до 40 поверхностных детерминант.

Как следует из кривой преципитации (рис.1), по мере добавления антигена вначале достигается оптимум, а затем количество образующегося преципитата постепенно уменьшается.

ХАРАКТЕРИСТИКА иммунологических методов анализа и диагностики - №1 - открытая онлайн библиотека

Рис.1. Количественная реакция преципитации между овальбумином кролика и специфическими антителами. Антитела в основном представляют собой IgG.

К постоянному объему антисыворотки в нескольких пробирках добавляют различное количество овальбумина. После инкубации преципитат осаждают центрифугированием и взвешивают. Супернатант разделяют на две части: к одной добавляют антиген, а к другой - антитела, и тем самым определяют наличие в супернатанте соответственно антител и антигена.

Количество антител в сыворотке можно вычислить по точке эквивалентности, в которой супернатант не содержит ни антител, ни антигена.

В этой точке весь добавленный антиген образует преципитат со всем доступным количеством антител. Количество антител в 0,1 мл сыворотки тем самым соответствует разности веса преципитата и веса добавленного антигена.

Анализ преципитата, образованного при избытке антител, когда практически все детерминанты антигена связаны с антителами, позволяет определить молярное соотношение антител и антигена и таким образом оценить эффективную валентность антигена.

При этом в супернатанте появляются растворимые комплексы антигена (Аг) и антител (Ат), многие из которых имеют строение Аг4Ат3, Аг3Ат2 и Аг2Ат (рис.2 ). При большом избытке антигена (рис.1 ), как показывает метод ультрацентрифугирования, комплексы преимущественно имеют строение Аг2Ат, что хорошо согласуется с наличием двух антигенсвязывающих центров, т.е. двухвалентностью молекул IgG. Во всех промежуточных случаях, в реакции антиген-антитело образуются трехмерные сетевидные структуры, которые соединяются между собой преимущественно за счет взаимодействия Fс-фрагментов и формируют крупные осаждающиеся агрегаты.

ХАРАКТЕРИСТИКА иммунологических методов анализа и диагностики - №2 - открытая онлайн библиотека

Рис.2. Комплексы, образуемые между гипотетическим четырехвалентным антигеном и двухвалентными антителами, смешанными в разных соотношениях.

Практически трудно допустить, что участки связывания антигена лежат в одной плоскости и образованы идентичными детерминантами (как это показано на рисунке).

а. При огромном избытке антител все участки связывания антигена заняты и по молярному соотношению Ат:Аг в комплексах можно оценить валентность антигена,

б. В точке эквивалентности образуются крупные комплексы, которые затем агрегируют и образуют типичный преципитат. Агрегация и преципитация ингибируются при высокой концентрации соли.

в. При большом избытке антигена заняты два антигенсвязывающих центра каждой молекулы антитела, и доминирует комплекс Аг2Ат.

г. Моновалентный гаптен соединяется с молекулами антител, но не способен к их перекрестному связыванию.

Прежде чем говорить о вариантах реакции, следует заметить, что нерастворимый комплекс антиген - антитело выпадает только в определенном диапазоне эквивалентных концентраций реагирующих молекул. В случае большого избытка антител или антигена феномен преципитации не развивается. Это не значит, что взаимодействия реагентов не произошло. Оно произошло, но образовался растворимый комплекс антиген-антитело. Реакция кольцепреципитации ставится таким образом, что в пробирке на столбик иммунной сыворотки, содержащей антитела, наслаиваются различные разведения прозрачного раствора антигена. На границе соприкосновения двух взаимодействующих растворов антигена и антител через несколько минут или часов возникает опалесцирующее кольцо преципи-тации.

Количественные измерения методом нефелометрии.

Небольшие агрегаты, образующиеся при смешивании разбавленных растворов антигена и антител, увеличивают мутность раствора, которая мо­жет быть измерена по рассеянию падающего света (нефелометрия). Увеличение чувствительности достигается при использовании монохрома-тического света лазера и при добавлении в раствор полиэтиленгликоля, увеличивающего размер агрегатов.

В хорошо оснащенных лабораториях, которым доступно соответствующее оборудование, данный метод постепенно вытесняет простую радиальную иммунодиффузию при количественной оценке иммуноглобулинов, компонента комплемента С3, С-реактивного белка и т.д.

Весьма удобен вариант реакции преципитации в стеклянных капиллярах. Капилляр опускают в сосуд с иммунной сывороткой и заполняют треть пространства внутри капилляра. Затем капилляр переносят в раствор антигена и заполняют еще треть капилляра. После этого капилляр перевора-чивают несколько раз и оставляют на 18-24 ч. Зерна преципитата собираются столбиком на нижнем мениске капилляра.

В последние годы широко используют реакцию преципитации в агаре мето-дом двойной или встречной диффузии.

Визуализация реакции преципитации в гелях. Двойная диффузия по Ухтерлони.

В лунки, вырезанные в агарозном геле, помещают антиген и антитела. Они диффундируют навстречу друг другу и образуют преципитат (мутно-белая линия) в том участке геля, где их соотношение оптимально. Если препарат содержит несколько антигенов, то образуется несколько линий. Иммунологическое родство между двумя антигенами можно оценить, проводя реакции преципитации в соседних лунках. Образованные каждым из антигенов линии могут либо полностью сливаться- это указывает на их иммунологическую идентичность, либо сливаться частично и образовывать так называемую «шпору»-это свидетельствует о частичном родстве антигенов, либо в случае неродственных антигенов пересекаться.

Рис..3. Двойная иммунодиффузия по Ухтерлони. Когда кроличья антисыворотка (центральная лунка) реагирует в агаровом геле с четырьмя различными антигенами (периферические лунки), образуются линии преципитации. В случае неродственных антигенов эти линии пер­секаются, при частичном родстве формируются «шпоры».

ХАРАКТЕРИСТИКА иммунологических методов анализа и диагностики - №3 - открытая онлайн библиотека

Причины формирования различных линий преципитации объяснены на рис. 4. Следует подчеркнуть, что даже полностью сливающиеся линии свидетельствуют лишь об иммунологической идентичности, причем только для данной антисыворотки, а вовсе не об идентичности самих молекул антигенов. Так, например, очищенные антитела к динитрофенилу (ДНФ) дадут сливающиеся линии при реакции с ДНФ- овальбумином и ДНФ- сывороточным альбумином, если эти антигены поместить в соседние лунки.

ХАРАКТЕРИСТИКА иммунологических методов анализа и диагностики - №4 - открытая онлайн библиотека

Рис. 4. а. Линии преципитации сливаются, когда два антигена с помощью данной антисыворотки неразличимы,

б. Образование «шпоры» при частичном родстве антигенов. Если антигены имеют общую детерминанту х и различные детерминанты у и z, а антисыворотка специфична по отношению к х и у, то антиген с детерминантами х и z может реагировать только с антителами, направленными к х. Антитела к у (Ату) пересекают линию преципитации и реагируют с антигеном из соседней лунки, имеющим детерминанту у; в результате об­разуется «шпора»,

в. Пересечение линий преципитации в случае неродственных антигенов.

Там, где реагенты присутствуют в сбалансированном соотношении, выпуклость образующейся линии преципитации будет направлена в сторону того из них -антигена или антитела, у которого меньше мол. масса. Это есть следствие меньшей скорости диффузии, которую обычно имеют молекулы с большим размером.

Чувствительность метода преципитации в геле можно повысить, если ввести антисыворотку в агар; при этом в гель диффундирует только антиген (агар может содержать до 90% сыворотки;). Данный метод, называемый простой радиальной иммунодиффузией, используется для количественного определения антигена.

Чашки заливают агаром, в котором делают две или больше лунок. В одну вносят антиген, в другую - иммунную к нему сыворотку. Происходит диффузия реагентов в агар, и, на месте встречи антигена и антител в зоне их эквивалентности образуются полосы преципитации. Эта реакция носит аналитический характер и позволяет определить количество отдельных антигенных субстанций в смеси антигенов, а также установить идентичность сравниваемых антигенов. Широко распространенным вариантом метода является метод радиальной иммунодиффузии.