Практична робота. Дослід 1. Кількісне визначення сечової кислоти в сироватці крові

Дослід 1. Кількісне визначення сечової кислоти в сироватці крові.

Принцип методу.Сечова кислота відновлює фосфатвольфраматний реактив з утворенням сполуки блакитного кольору, оптична густина якої за довжини хвилі 640 нм є пропорційною концентрації сечової кислоти у сироватці крові.

Матеріальне забезпечення:сироватка або плазма крові, 10 % розчин натрію дигідрогенвольфрамат дигідрату, 10 % розчин натрію карбонату, 0,35 М розчин сульфатної кислоти, фосфатвольфраматний реактив (реактив Фоліна), 30 мкМ розчин сечової кислоти, піпетки, пробірки, центрифуга.

Хід роботи:У центрифугову пробірку вміщують 0,5 мл сироватки крові та 4 мл дистильованої води. Вміст пробірки перемішують і додають 0,25 мл 0,35 М розчину сульфатної кислоти та 0,25 мл 10% розчину натрію дигідрогенвольфрамат дигідрату. Вміст пробірки перемішують і через 5 хв центрифугують протягом 10 хв за швидкості 3000 об/хв. Проводять визначення сечової кислоти за наступною схемою.

Визначення сечової кислоти в сироватці крові

  Контрольна проба Стандартна проба Дослідна проба
Надосадова рідина, мл - -
Стандартний розчин сечової кислоти, мл - -
Вода дистильована, мл - -
Розчин натрію карбонату, мл
Фосфатвольфраматний реактив, мл 0,5 0,5 0,5

Вміст пробірок перемішують. Через 30 хв визначають оптичну густину стандартної та дослідних проб за довжини хвилі 640 нм (590-700 нм, червоний світлофільтр) проти контрольної проби у кюветі затовшки 10 мм. Забарвлення є стабільним протягом 30 хв.

Розрахунок вмісту сечової кислоти проводять за формулою:

Адосл

С = × 30 × 10,

Астанд

де: С – вміст сечової кислоти у дослідній пробі, мкмоль/л;

Адосл – оптична густина дослідної проби;

Астанд – оптична густина стандартної проби;

30 – вміст сечової кислоти у стандартному розчині, мкмоль/л;

10 – величина розведення сироватки.

У чоловіків вміст сечової кислоти у сироватці крові становить 240-500 мкмоль/л, у жінок – 160-400 мкмоль/л.

Пояснити отримані результати. Зробити висновок.

Дослід 2. Кількісне визначення сечової кислоти в сечі.

Принцип методу.Метод грунтується на здатності сечової кислоти відновлювати фосфатвольфраматний реактив до фосфатвольфраматного синього, інтенсивність забарвлення якого пропорційна вмісту сечової кислоти. Кількість фосфатвольфраматного синього визначають шляхом титрування червоною кров’яною сіллю. Остання окиснює фосфатвольфраматний синій і синє забарвлення зникає.

Матеріальне забезпечення:сеча, фосфатвольфраматний реактив Фоліна, 20% розчин натрію карбонату Na2CO3, 0,01н розчин калію фериціаніду K3[Fe(CN)6] (червона кров’яна сіль), стандартний розчин сечової кислоти (0,5 мг в 1 мл), мікробюретки, колбочки для титрування, піпетки, пробірки.

Хід роботи:Паралельно до 1,5 мл сечі та 1,5 мл стандартного розчину сечової кислоти додають по 1 мл 20% розчину натрію карбонату і по 1 мл фосфатвольфраматного реактиву Фолінa, змішують і титрують 0,01 н розчином калію фериціаніду до зникнення синього забарвлення.

Вміст сечової кислоти (в міліграмах) в добовій сечі вираховують за формулою:

0,75 × В × D

Х =

1,5 × С

де, 0,75 - кількість сечової кислоти у стандартній пробі, мг; B – кількість калію фериціаніду, що пішла на титрування дослідної проби сечі, мл; C – кількість калію фериціаніду, що пішла на титрування стандартної проби сечової кислоти, мл; D – добовий діурез, мл.

Коефіціент перерахунку в одиниці СІ (ммоль/добу) дорівнює 0,0059.

Пояснити отримані результати. Зробити висновок.

Клініко-діагностичне значення.Утворена в результаті розпаду пуринових основ сечова кислота виділяється нирками. У нормі в людини з сечею виділяється 1,60-3,54 ммоль/добу (270-600 мг/добу) сечової кислоти. Нормальний вміст сечової кислоти в сироватці крові становить для чоловіків – 240 – 530 мкмоль/л (0,05-0,06 г/л), для жінок приблизно на 25 % менше – 185-440 мкмоль/л (0,04-0,05 г/л). Гіперурікемія – зростання концентрації сечової кислоти у крові, гіперурикурія (гіперуратурія) – збільшення вмісту сечової кислоти у сечі. Гіперурикемія викликає подагру, захворювання, що виникає за умов преципітації уратів у тканинах, у першу чергу, в суглобах. Сечова кислота та її солі надзвичайно погано розчиняються у воді, нормальні концентрації їх в рідинах організму наближені до межі розчинності. Для лікування подагри використовують препарати, що гальмують утворення сечової кислоти (алопуринол) або стимулюють виведення її нирками (антуран, цинхофен). У хворих на подагру значення концентрації сечової кислоти у крові майже завжди перевищує 0,075-0,080 г/л, а під час утворення у них подагричних ущільнень вміст її рідко буває нижчим ніж 0,08-0,09 г/л.

Контроль виконання лабораторної роботи

1. Пояснити принцип методу визначення вмісту сечової кислоти в біологічній рідині з реактивом Фоліна. Клініко-діагностичне значення визначення сечової кислоти в крові та сечі.

2. Похідне уридину, фторурацил, перетворюється в клітині на фтордезоксіуридилат – сильний незворотній інгібітор тимідилатcинтази. Як пояснити факт пригнічення фторурацилом швидкого поділу ракових клітин у експериментальних тварин?

Приклади тестів “Крок-1”

1. У сечі місячної дитини виявлено підвищений вміст оротової кислоти. Дитина погано набирає масу тіла. Які речовини потрібно використати для нормалізації метаболізму?

А. Уридин

B. Аденозин

C. Гуанозин

D.Тимідин

E. Гістидин

2. Утворення тимідилових нуклеотидів, які використовуються для біосинтезу ДНК, відбувається з дУДФ, що спершу гідролізується до дУМФ, а далі метилюється. Яка сполука слугує донором метильних груп?

A. Лецитин

B. Холін

C. Метилентетрагідрофолат

D. Метіонін

E. Карнітин

3. У реакції перетворення рибози на дезоксирибозу під час утворення дезоксирибонуклеотидів, що використовуються для синтезу ДНК, бере участь низькомолекулярний білок тіоредоксин. Він містить дві SH-групи, що можуть переходити в окиснену форму. Який коензим використовується для відновлення тіоредоксину?

А. Коензим Q

B. ПАЛФ

C. НАДФН

D. НАДН

E. АМФ

4. Чоловіка віком 60 років прооперували з приводу раку простати. Через 2 місяці йому призначили курс хіміотерапії. До комплексу лікарських препаратів входив 5-фтордезоксіуридин – інгібітор тимідилатсинтази. Синтез насамперед якої речовини блокується під дією цього препарату?

А. іРНК

B. рРНК

C. тРНК

D. ДНК

E. Білка


Індивідуальна самостійна робота студентів

1. Особливості процесів синтезу та розпаду пуринових і піримідинових нуклеотидів в нормі та при патології.

2. Роль аденілових нуклеотидів в регуляції активності ферментів.

Література

Основна:

1. Губський Ю.І.. Біологічна хімія. Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. - С. 270-283.

2. Губський Ю. І. Біологічна хімія. – Київ-Вінниця: Новакнига, 2009. – С. 328-343.

3. Гонський Я.І., Максимчук Т.П. Біохімія людини.-Тернопіль: Укрмедкнига, 2001.- С. 448-462.

4. Біологічна хімія. Тести та ситуаційні задачі. / За ред. О.Я. Склярова. – Львів: Світ, 2006. – 271 с.

5. Біохімічний склад рідин організму та їх клініко-діагностичне значення /За ред. проф. Склярова О.Я.- Київ: Здоров’я, 2004.-191с.

6. Практикум з біологічної хімії. / За ред О.Я.Склярова .-К.: Здоров’я, 2002.-180-189 с.

Додаткова:

1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия.- М.: Медицина, 1998. – С. 469-508.

2. Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия. - М.: Мир, 2000. - С. 188-193.

3. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. Т.2. – М.: Мир; Бином. Лаборатория знаний, 2009. – С. 15-34.

4. Мещишен І.Ф., Яремій І.М. Особливості обміну речовин у дітей. – Чернівці: БДМА, 2003. - С.18-25.

Тема № 3. Дослідження реплікації ДНК та транскрипції РНК. Аналіз механізмів мутацій, репарацій ДНК. Засвоєння принципів отримання рекомбінантних ДНК, трансгенних білків.

Мета заняття: Знати закономірності матричного синтезу нуклеїнових кислот, етапи цих процесів, механізми мутацій, репарацій та виникнення і розвитку спадкових захворювань. Засвоїти механізм дії антибіотиків та інших інгібіторів синтезу нуклеїнових кислот. Вміти кількісно визначити вміст ДНК у біологічному матеріалі.

Актуальність теми: В процесі біосинтезу нуклеїнових кислот можливі різноманітні порушення нуклеотидної послідовності під впливом фізичних (нагрівання, іонізуючі, корпускулярні опромінення), хімічних (мутагени) та біологічних (віруси) факторів. У медичній практиці широко використовуються фармацевтичні препарати, що інгібують біосинтез нуклеїнових кислот у прокаріотичних організмах та гальмують поділ клітин пухлин у онкологічних хворих.

Конкретні завдання:

Ø Оволодіти методом кількісного визначення ДНК в біологічному матеріалі з метою оцінки інтенсивності реплікаційних та біосинтетичних процесів.

Ø Трактувати молекулярно–біологічні закономірності збереження та передачі генетичної інформації, роль ферментних систем, що забезпечують напівконсервативний механізм реплікації ДНК у прокаріотів та еукаріотів.

Ø Пояснювати механізми функціонування ферментної системи транскрипції РНК.

Ø Трактувати механізми регуляції експресії генів на рівні транскрипції оперонів, які включають структурні та регуляторні гени, промотор та оператор.

Ø Трактувати біохімічні механізми генетичних рекомбінацій, ампліфікації генів, особливості регуляції експресії генів у еукаріотів.

Ø Аналізувати наслідки геномних, хромосомних та генних мутацій, механізми дії найбільш поширених мутагенів, біологічне значення та механізми репарації ДНК (репарація УФ–індукованих генних мутацій).

Теоретичні питання

1. Реплікація ДНК: біологічне значення; напівконсервативний механізм реплікації (схема експерименту М.Мезелсона та Ф.Сталя).

2. Загальна схема біосинтезу ДНК. Ферменти реплікації ДНК у прокаріотів та еукаріотів (розплітаючі білки, праймаза, ДНК-полімерази, ДНК-лігаза). Етапи синтезу дочірніх ланцюгів молекул ДНК (значення антипаралельності ланцюгів ДНК; фрагментів Оказакі).

3. Транскрипція РНК. РНК–полімерази прокаріотів та еукаріотів. Будова транскриптона (оперона). Сигнали транскрипції: промоторні, ініціаторні, термінаторні ділянки генома. Етапи синтезу РНК. Значення зворотної транскриптази. Антибіотики – інгібітори транскрипції.

4. Процесинг – посттранскрипційна модифікація РНК; етапи процесінгу.

5. Регуляція експресії генів прокаріотів: схема регуляції за Ф. Жакобом та Ж. Моно. Будова Lac–оперону E.сoli, принципи його функціонування (репресія, індукція).

6. Регуляція експресії генів еукаріотів на рівні транскрипції; cистема транскрипційних сигналів – промоторні послідовності, енхансери, атенюатори, сайленсери.

7. Особливості молекулярної організації та експресії геному в еукаріотів. Ядерний хроматин еукаріотів; ковалентна модифікація гістонів та НГБ як один з механізмів контролю експресії генів.

8. Генетичні рекомбінації; транспозони. Рекомбінації геному прокаріотів (трансформація, трансдукція, кон’югація). Процеси рекомбінації у еукаріотів на прикладі утворення генів H– та L–ланцюгів молекул імуноглобулінів.

9. Ампліфікація генів (гени металотіонеїну, дигідрофолатредуктази): визначення, біологічне значення.

10. Мутації: геномні, хромосомні, генні (точкові); роль у виникненні ензимопатії та спадкових хвороб людини. Біохімічні механізми дії хімічних мутагенів – аналогів азотистих основ, дезамінуючих, алкілуючих агентів, ультрафіолетового та іонізуючого випромінювання.

11. Біологічне значення та механізми репарації ДНК. Репарація УФ-індукованих генних мутацій; пігментна ксеродерма; репарація дезамінування цитозину.