Правила и этапы приготовления препаратов для гистологического исследования

3.1.Определите суть следующих основных понятий

Биопсия Метод исследования, при котором проводится прижизненный забор клеток или тканей (биоптата) из организма с диагностической или исследовательской целью. Биопсия является обязательным методом подтверждения диагноза при подозрении на наличие онкологических заболеваний.
Фиксация Метод обработки ткани с целью закрепления ее прижизненной структуры.
Обезвоживание Способ удаления воды из различных материалов с целью получения обезвоженного продукта.
Уплотнение или заливка Процесс создания блока, достаточно твердого, чтобы быть пригодным для резки (микротомирования).
Микротомия Подготовка гистологических срезов при помощи микротома для последующего микроскопического исследования.
Базофилия Химическое сродство к основаниям, в том числе, к осно́вным красителям. Базофилией в гистологии называют способность клеточных структур окрашиваться основными (щелочными) красителями (азуром, пиронином, гематоксилином и др.), обусловленная кислотными свойствами окрашивающихся компонентов клетки, главным образом нуклеиновых кислот (ДНК и РНК).
Оксифилия Свойство цитоплазмы и других элементов клетки или волокнистых структур окрашиваться кислыми красителями (эозином, кислым фуксином и др.)
Гистохимия Раздел гистологии, изучающий локализацию различных химических веществ и продуктов их метаболизма в тканях.
Авторадиография Метод изучения распределения радиоактивных веществ в исследуемом объекте наложением на объект чувствительной к радиоактивным излучениям фотоэмульсии.
Иммуноцитохимия Метод морфологической диагностики, в основе которого лежит визуализация и оценка с помощью микроскопа результатов реакции антиген-антитело непосредственно в гистологических срезах.
Световая микроскопия Микроскопия, при которой увеличенное изображение получают с помощью оптического прибора (микроскопа), в структуру которого входят компоненты, использующие пучок света для создания видимого поля.
Электронная микроскопия Совокупность методов исследования с помощью электронных микроскопов микроструктур тел, их локального состава и локализованных на поверхностях или в микрообъемах тел электрических и магнитных полей.
Сканирующая микроскопия Метод анализа поверхностной структуры микрообъекта путем анализа отраженного «электронного изображения» (как правило, при специальном напылении и с применением метода замораживания-высушивания, что позволяет повышать электронную плотность объекта и предотвращать деформации клеточных и др. структур).
Морфометрия Включает совокупность приемов и методов определения геометрических характеристик исследовательских объектов-гистологических препаратов (срезов, мазков, отпечатков и т.п.) и микрофотографий.

3.2. Отметьте в таблице название основных этапов изготовления гистологического препарата и укажите кратко сущность каждого из них



Этапы изготовления гистологического препарата Сущность этапа
Взятие материала Берут кусочки органов и тканей величиной не более 1 см³. Материал желательно получать как можно раньше после смерти людей (метод исследования материала трупа человека - аутопсия). С диагностической целью материал для гистологического исследования может забираться у людей прижизненно с помощью специальных инструментов или во время операций. Этот способ получения материала носит название биопсии.  
Фиксация Фиксация – метод обработки ткани с целью закрепления ее прижизненной структуры. Это достигается путем воздействия на ткань специальных растворов (фиксаторов). Наиболее существенным изменением, происходящим в тканях под воздействием фиксатора является процесс свертывания (коагуляции) белков. Количество фиксатора следует брать в 20-100 раз больше объема кусочка фиксируемого материала.
Помывка в воде После фиксации материал промывают (чаще всего в течение нескольких часов в проточной воде) с тем, чтобы избавить его от избытка фиксатора и различных осадков фиксирующих жидкостей. Изучить с помощью микроскопа такие фиксированные кусочки органов невозможно, т.к. они не прозрачны. Чтобы кусочек органа можно было микроскопировать, его надо разрезать на очень тонкие пластинки – срезы. Такие срезы получают с помощью микротомов. для того, чтобы резать на микротоме кусочек ткани, ее надо предварительно уплотнить. Это достигается путем пропитывания застывающими жидкостями – расплавленным парафином. Парафин в воде не растворяется, и поэтому промытый после фиксации кусочек ткани необходимо предварительно обезводить, и только затем пропитывать.  
Обезвоживание Обезвоживание ткани производятся постепенно (чтобы не произошло сморщивания) путем проведения ее через спирты возрастающей крепости: 50º, 60º, 70º, 80º, 90º, 96º, 100º. В каждом спирте кусочки находятся от нескольких часов до 1 суток в зависимости от величины кусочка.
Уплотнение (заливка) При заливке кусочки предварительно пропитываются теми жидкостями, которые служат растворителями для парафина (ксилол или толуол). При заливке в парафин кусочки из абсолютного спирта переносятся в смесь абсолютного спирта с хлороформом или ксилолом, взятых поровну, затем чистый ксилол и, наконец, в расплавленный насыщенный раствор парафина в хлороформе, где они находятся в термостате при температуре 37º до 1 суток и более. Дальнейшая заливка проводится в термостате при температуре 54º -56º в трех порциях парафина. Окончательная заливка проводится в парафин с добавлением воска, который наливают в специальные бумажные коробочки или стеклянные чашки, а затем эти коробочки или чашки после появления на поверхности парафина пленки, погружают в воду. Происходит полное затвердение парафина. Кусочки с окружающим их парафином извлекают из коробочек и с помощью расплавленного парафина, наклеивают на деревянные кубики, получаются парафиновые блоки. Уплотнения также можно добиться замораживанием кусочка органа (срочная биопсия).
Приготовление срезов Срезы с блоков изготовляются на микротоме. Наиболее распространены микротомы санный и замораживающий. В специальных устройствах микротома зажимается парафиновый блок и микротомный нож.
Окрашивание Перед окраской из парафиновых срезов обязательно удаляют парафин (растворением в ксилоле). Окрашивание необходимо производить для того, чтобы отчетливо выявить под микроскопом тонкие структуры объекта. По окрашиванию определенных гистологических структур различают краски ядерные (окрашивание ядра), цитоплазматические (окрашивающие цитоплазму), и специальные, окрашивающие избирательно определенные структуры.
Заключение среза Окрашенные и промытые в воде срезы во избежание помутнения обезвоживают в спиртах (70º, 96º), просветляют в карбол-ксилоле, ксилоле, а затем на предметное стекло, где находится срез, помещают каплю бальзама и срез накрывают покровным стеклом. Бальзам представляет собой растворенную в ксилоле смолу одного из видов сосны, растущей в Канаде (канадский бальзам), смолу пихты (сибирский бальзам) или специальную синтетическую среду. При исследовании биопсий с целью уточнения диагноза в гистологических лабораториях прибегают к ускоренной обработке материала. Кусочки тканей и органов при этом проходят те же этапы обработки, но за 5-7 дней. Иногда производится так называемая срочная биопсия, когда в течение 15-80 мин. материал фиксирует, получают срезы, окрашивают их и заключают. Быструю фиксацию производят в 10% формалине, подогреваемом пламенем горелки или с использованием СВЧ-печи. Уплотнения добиваются замораживанием (хлорэтилом, углекислотой или с помощью замораживающего микротома).

3.3. Основные гистологические красители и реакции (в столбце "результат" заполняется, в какой цвет окрашиваются красителями ядра, цитоплазма, включения, волокна и т.д.)



Реагент Результат
Гематоксилин Окрашивает базофильные клеточные структуры ярко-синим цветом. Базофильные структуры, как правило, это те, которые содержат нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК): клеточное ядро, рибосомы и РНК-богатые участки цитоплазмы.
Эозин Окрашивает эозинофильные структуры клетки красно-розовым цветом. Эозинофильные структуры содержат внутри- и внеклеточные белки, например, тельца Леви. Цитоплазма является эозинофильной средой. Эритроциты всегда прокрашиваются ярко-красным цветом.
Орсеин Используется для выявления эластиновых волокон, особенно это актуально в патологической анатомии кровеносных сосудов. Эластические волокна соединительной ткани окрашиваются в тёмно-красный цвет; остальные структуры - в слабо-розовый цвет.
Серебрение Солями серебра используют для выявления нервных клеток, нейроглиальных элементов, периферических нервных волокон и их окончаний, ретикулярной стромы органов, межклеточного вещества эпителия и гладкой мускулатуры, бледных трепонем и др. С целью улучшения качества препаратов срезы после серебра нередко тонируют солями золота, окрашивание в фиолетовый цвет.
Железный гематоксилин Железный гематоксилин Вейгерта должен окрашивать ядра в черный цвет. Если они приобретают коричневый цвет, то это свидетельствует о порче красителя. Железный гематоксилин Гейденгайна окрашивает в черный цвет не только ядра, но и митохондрии, темные диски скелетной и сердечной мышечной ткани и другие структуры.
Реактив Шиффа Позволяет выделить гликоген и гликопротеины (лиловый цвет). Соединительная ткань, хрящ, костная ткань, железистые клетки и структуры ткани почек окрашиваются в лиловый цвет. Ядро окрашивается в синий.
Романовский Гимза Посредством данного метода окраске подлежат ацидофильные образования в разные оттенки красного цвета. Образования базофильного характера окрашиваются в цвет от пурпурного до синего.

3.4.Заполните таблицу, перечислив основные группы красителей, укажите название структур, воспринимающих краситель, и примеры красителей

Группы красителей Название окрашиваемых структур Пример красителя
Основные, или ядерные, красители хроматин ядер, ядрышко гематоксилин, тионин, кармин, метиловый зеленый
Кислотные красители цитоплазматические структуры клеток, эритроциты эозин, кислый фуксин, Конго красный (конгорот), эритрозин
Нейтральные красители жиры и липоиды, ядра судан III, судан IV, метиленовый синий

4. Некоторые специальные методы приготовления и окрашивания препаратов (методика исследования биоматериала)

4.1. Практические задания. Напишите, как готовятся растворы, методику проведения реакции и результат.

Вариант 6. Окрашивание липидов суданом III.

Является наиболее распространенным методом выявления жира.

Приготовление раствора красителя.

В 100 мл горячего 70% спирта засыпают 0,2-0,3 г порошка судана III, несколько раз взбалтывают и ставят в термостат (при58°С) на несколько часов, затем охлаждают и фильтруют.

Метод.

1. Замороженные срезы (из свежей или фиксированной в формалине ткани) на несколько минут переносят из воды в 50% спирт.

2. Помещают в спиртовой раствор красителя на 15-30 мин (бюксы следует закрывать, так как испарение спирта приводит к выпадению осадков красителя).

3. Быстро ополаскивают в 50% спирте.

4. Промывают в дистиллированной воде.

5. Подкрашивают ядра кислым гемалауном.

6. Промывают и заключают в желатин или глицерин-желатин (обезвоживание в спиртах

экстрагирует жиры).

Результат.

Жировые вещества интенсивно оран­жевого цвета, ядра -"синие. Препараты выцветают сравнительно скоро, поэтому откладывать исследование не рекомендуется.

Вариант 11. Методы исследования кожи и ее производных. Окраска азаном.

Окрашивание азаном по методу Гейденгайна – является модификацией метода Маллори, что позволяет получать более четкоеокрашивание соединительной ткани, чем основной метод. Данную методику хорошо использовать при окраске железистой и других тканей. Окраска срезов лучше удается после сулемовых фиксаторов (жидкость Ценкера и её модификация по Максимову), можно и после простой формалиновой фиксации материала.

Приготовление растворов:

1. Раствор азокармина – к 100мл дистиллированной воды добавляют 0,1 г азокармина. Затем в течение нескольких минут кипятят и после охлаждения профильтровывают. К фильтрату добавляют 1 мл ледяной уксусной кислоты.

2. Раствор анилинового синего и оранжевого G - к 100мл дистиллированной воды добавляют 0,5 г анилинового синего, 2,0 г оранжевого G. Смесь кипятят в течение 2-3 минут, охлаждают и профильтровывают. Перед употреблением раствор разводят в 2-3 раза дистиллированной водой.

3. Раствор анилинового спирта – в 100 мл 90% спирта растворяют 0,1 мл анилинового масла (практически удобнее 1,0 мл анилинового масла растворить в 1 л спирта).

4. Уксуснокислый спирт – к 100 мл 96% спирта добавляют 1 мл ледяной уксусной кислоты.

5. Раствор фосфорно-вольфрамовой кислоты – 5 мг химически чистого препарата растворяют в 100 мл дистиллированной воды.

Окрашивание срезов проводят следующим образом:

1. Срезы переносят в раствор азокармина и помешают на 1,5- 2 часа в термостат с температурой 56-60 градусов. Срезы для этого помешают в хорошо закрывающиеся биологические стаканчики (или бюксы) с притертой пробкой.

2. Далее стаканчик со срезами охлаждают при комнатной температуре в течение 10-15 минут.

3. Срезы извлекают из стаканчиков (или бюкса), ополаскивают в дистиллированной воде.

4. Срезы переносят в раствор анилинового спирта и выдерживают до тех пор, пока не будут четко выявлены ядра (контроль под микроскопом). Если не удается долго выявить ядра, можно добавить в раствор дистиллированной воды, что ускорит процесс дифференцировки;

5. После дифференцировки ядер быстро промыть в течение 1-2 минуты уксуснокислым спиртом.

6. Протрава срезов в растворе фосфорно-вольфрамовой кислоты в среднем в течении 1-3 часов в зависимости от выявления элементов соединительной ткани под контролем микроскопа.

7. Ополаскивание в дистиллированной воде и переносят в разведенный раствор анилинового синего и оранжевого G – в течение 2-3 часов, после чего быстро ополаскивают в дистиллированной воде и переносят в 96% спирт для дифференцировки.

Результаты: при правильной дифференцировке коллагеновые и ретикулиновые волокна окрашиваются в синий цвет при отсутствии общего голубого тона, ядра клеток - в красный цвет. Мышечная ткань – в различные оттенки красно-оранжевого цвета.

Вариант 21. Методы исследования соединительных тканей. Импрегнация ретикулярных волокон серебром по способу Фута.

Фиксация материала в 15-20%-ном растворе формалина. После фиксации промывание в проточной воде 24-48 часов, а затем несколько часов в дистиллированной. Срезы получают на замораживающем микротоме. Работать только с химичес­ки чистыми реактивами, посуда безукоризненно чистая, пере­носят срезы только стеклянными иголками.

Необходимые материалы

0,25%-ный водный раствор марганцевокислого калия.

5%-ный раствор щавелевой кислоты.

2%-ный раствор азотнокислого серебра.

Раствор аммиачного серебра: на каждые 5 мл 10%-ного раствора AgNO3 прибавляют 4-5 капель 40%-ного водного раствора (гидрата окиси аммония) NH4OH. Образуется осадок (темно-бурый) гидрата окиси серебра. Осадок растворяют 25%-ным нашатырным спиртом, добавляя его по каплям, хорошо взбалтывая. На 5 мл 10%-ного AgNO3 необходимо 15-25 капель 25%-ного NH4OH.

Гидрат окиси аммония.

5%-ный раствор формалина.

0,5-1%-ный раствор хлорного золота.

5%-ный водный раствор гипосульфита.

Дистиллированная вода.

Ход окраски

1.Замороженные срезы из дистиллированной воды переносят в 0,25%-ный водный раствор марганцевокислого калия на 5-10 мин.

2.Споласкивают в водопроводной воде.

3.Выдерживают в 5%-ном растворе щавелевой кислоты 15-30 мин (до побеления срезов).

4.Тщательно промывают (20-30 мин) в большом количестве дистиллированной воды.

5.Выдерживают в темноте 48 часов в 2%-ном растворе азотнокислого серебра (AgNO3).

6.Быстро (3-5 сек) споласкивают в дистиллированной воде.

7.Выдерживают 15-20 мин в свежеприготовленном и профильтрованном растворе аммиачного серебра.

8.Споласкивают в дистиллированной воде (5-15 сек, вре­мя выбирают эмпирическим путем).

9.Помещают в 5%-ный раствор формалина на 15-30 мин

10.Тщательно промывают в водопроводной воде.

11.Перекладывают в 0,5- 1%-ный раствор хлорного золо­та (АиС13) на 5-10 мин.

12.Промывают в водопроводной воде (10-15 мин).

13.Обрабатывают в 5%-ном водном растворе гипосульфита 1-3 мин. Контролируют под микроскопом, споласкивая в воде.

14. Тщательно промывают в водопроводной воде - от нескольких часов до суток.

Ядра клеток докрашивают квасцовым кармином или гематоксилином.

Проводят через спирт, карбол-ксилол и заключают в бальзам. Результаты окраски: ретикулярные волокна черные, коллагеновые волокна фиолетовые, коричневые или серовато-черные.

ПРИЛОЖЕНИЕ 2

Комплект тестовых заданий

по производственной (специализированной) практикепо темам

модуля 1 – Цито- и гистологические методы исследования

Тестовые задания по технике безопасности при работе в гистологической лаборатории

Вопрос 6. Рабочая поверхность стола для лаборантов должна быть площадью не меньше:

- 100×30 см

- 50×50 см

- 120×60 см

- 200×100 см

- 140×80 см

Вопрос 11. В отделении следует провести ряд гистохимических исследований, а для фиксации кусочков ткани необходим нейтральный формалин, которого нет в отделении. Нейтрализация формалина производится с помощью добавления к нему:

- уксусной кислоты

- азотнокислого серебра

- углекислой магнезии

- медного купороса

- пикриновой кислоты

Вопрос 21. Начало формы

С какой целью под стеклом рабочего стола лаборанта должен находится белый лист бумаги размером 9×12 см:

- для создания соответствующего фона, облегчающего работу с окрашенными объектами

- для записи наиболее распространенных методик окраски

- для создания соответствующего фона, облегчающего работу с неокрашенными объектами

- для решения вопроса о качестве фиксации кусочка ткани

- для улучшения качества заливки кусочков ткани в парафин

Вопрос 31. При маркировке материала в растворе формалина, запись проводят с помощью:

- акварельных красок

- авторучки с красной пастой

- авторучки с синей пастой

- простого карандаша

- авторучки с черной пастой

Вопрос 41. Норма расхода спирта на один объект биопсии:

- 10 г

- 20 г

- 30 г

- 40 г

Тестовые задания по теме "Техника гистологического исследования"

1. Помещения для проведения гистологических исследований включают:

- комната для приёма и вырезки операционно-биопсийного материала;

- гистологическая лаборатория;

- фиксационная и моечная комнаты;

- комната для хранения гистологического архива.

2. Отметьте необходимые документы в патологоанатомическом отделении:

- протокол патологоанатомического вскрытия;

- бланки врачебного свидетельства о смерти;

- бланк-направление на гистологическое и цитологическое исследование;

- алфавитная книга операционного и биопсийного материала;

- журнал регистрации операционно-биопсийного материала.

3. Ответственность за правильность оформления врачебного свидетельства о смерти несёт:

- заведующий отделением;

- врач, подписавший свидетельство о смерти;

- лаборант, заполняющий свидетельство о смерти.

4. Сроки хранения влажного архива, блоков и стёкол в паталогоанатомическом отделении при часто встречающейся патологии:

- 1 год;

- 10 лет;

- пожизненно;

- 2 года;

- 6 месяцев.

10.При фиксации в кислом формалине в срезах может образоваться тёмно-коричневый пигмент в виде глыбок, который удаляют, помещая срезы в:

- 1-5% раствор аммиака;

- 70% спирт;

- 10% раствор лимонной кислоты.

11. Назовите фиксаторы, используемые для костной ткани:

- формалин;

- жидкость Карнуа;

- жидкость Буэна;

- жидкость Гелли (ценкер-формол);

- этиловый спирт.

12. Декальцинацию костного материала проводят в:

- азотной кислоте;

- трилоном Б;

- муравьиной кислоте;

- формалином;

- пикриновой кислоте.

13.Обезвоживание тканей возможно с помощью:

- этилового спирта восходящей концентрации;

- 99% изопропилового спирта;

- диоксана;

- глицерина.

20. Температура плавления твёрдого парафина: - 38-46ºС; - 56-58ºС; - 52-56ºС; - 68-76ºС. 21. Парафин растворяется в: - спирте; - хлороформе; - ксилоле; - соляной кислоте; - серной кислоте. 22. Эластичность парафину придаёт: - касторовое масло; - воск; - ксилол; - дибутилфталат; - вазелиновое масло. 23. Парафин и хлороформ для составления парафиновой каши берутся в соотношении: - 1:3; - 1:1; - 1:10; - 1:20; - 1:4.  

30. Срезы могут быть сморщенными, закручиваться из-за:

- недостаточного угла наклона ножа;

- загрязнения парафина;

- высокой температуры в помещении;

- низкой температуры в помещении;

- заливки материала в легкоплавкий парафин.

31.Если срезы сморщенные, закручиваются, нужно:

- увеличить угол наклона ножа;

- перед получением срезов поместить материал в холодильник;

- декальцинировать объект;

- перезалить в более тугоплавкий парафин;

- уменьшить угол наклона ножа.

31. Причина, прилипания среза к ножу:

- высокая температура в помещении;

- плохая пропитка материала;

- электризация.

33.Если срез прилипает к ножу, нужно:

- перед получением среза подышать на блок;

- перед получением среза поместить блок в холодильник;

- перезалить в более тугоплавкий парафин;

- сменить нож на хорошо заточенный.

40. Если при работе на замораживающем микротоме ткань крошится, нужно:

- ткань слегка подморозить;

- «подогреть» ткань пальцем;

- взять другой кусочек ткани из архива;

- поместить кусочек ткани в физиологический раствор.

41.Замороженные срезы хранят:

- в 5-12% формалине;

- в 70% спирте;

- в 96% спирте.

42. Критерий достаточной обработки срезов в ксилоле:

- потемнение кусочка;

- просветление кусочка;

- изменение цвета кусочка.

43.Назовите оптимальный угол наклона ножа в санном микротоме:

- 7-9 градусов;

- 13-15 градусов;

- 25-30 градусов.

65. Результат окраски гематоксилином-эозином:

- ядро красное, цитоплазма жёлтая;

- ядро синее, цитоплазма розовая;

- ядро и цитоплазма синие;

- ядро не окрашивается, цитоплазма голубая.

66. Методы определения полисахаридов:

- ШИК-реакция;

- окраска по Ван-Гизону;

- метод Беста;

- окраска гематоксилином и эозином;

- метод Шабадаша.

67.Метод выявления кислых глизаминогликанов:

- метод Хейла;

- метод Гриммелиуса;

- метод Оса;

- метод Фельгена;

- метод Браше.

68. Фуксиленом окрашиваются волокна:

- коллагеновые;

- ретикулярные;

- эластические.

69. Вещество, которое выявляется при помощи реакции Шабадаша:

- жиры;

- гликоген;

- белки;

- кальций;

- железо.

Ситуационные задачи по теме "Методы и техника микроскопии"

Задача 5. При изучении микропрепарата в световом микроскопе интересуемая структура находится у края поля зрения, справа. В какую сторону следует переместить микропрепарат на предметном столике микроскопа, чтобы она оказалась в центре поля зрения?

Ответ: влево.

Задача 7. Исследователю предстоит изучить структуры клетки размером меньше 0,2 мкм. Какие методы исследования нужно ему рекомендовать?

Ответ: ультрафиолетовую микроскопию (для рассмотрения доступны объекты размером 0,1 мкм), флюоресцентную (люминисцентную) микроскопию (для рассмотрения доступны объекты размером от 0,13 мкм(при использовании ближних УФ лучей) до 0,25 мкм( при использовании сине-фиолетовых лучей)).


ПРИЛОЖЕНИЕ 3